限制性內切酶: 使用前需要考慮的五件事 自20世紀70年代以來，使用限制酶來表征DNA的方法一直很受歡迎。如今，這種技術仍然是評估DNA序列簡單、快速的方法之一。與大多數實驗室試劑一樣，限制性內切酶可能是變化無常的。無論你是簡單地消化一個質粒，還是執行復雜的克隆或篩選程序，都需要考慮幾個主要的因素:
正確的使用條件
每一種酶都是不同的，需要特定的條件，例如:
BSA是許多限制性酶的穩定劑；有些酶不能長時間工作超過1-2個小時
大多數限制性酶在pH 7.2和pH 8.5之間有效地消化，使用合適的緩沖液很重要。
大多數商業供應商都有他們自己選擇和使用限制性內切酶的特別指南，使用前應了解清楚。
在雙重限制性酶消化時，如果兩種酶的佳條件不同，你可能需要部分地犧牲一種酶的活性。在分析結果時要考慮這一點。或者，可以進行連續的消化，先使用種酶，凝膠提取去除緩沖液組分，然后用第二種酶消化。如果使用這種方法，開始用多個管子進行相同反應可能是明智的，因為在凝膠提取過程中，可能會丟失很多材料。
甲基化作用
當細菌復制一個質粒時，它們通常將特定的CpG島甲基化。這些序列通常是甲基化的目標。 限制性酶切位點也可能由于與甲基化位點有重疊而無法切割。此時，限制性內切酶位點與旁側的序列恰巧組成Dam或者Dcm識別位點，并進而被甲基化而阻斷切割。因此在質粒構建設計酶切位點時，要充分考慮到這種情況。
在實驗室大腸桿菌菌株中有三種不同類型的甲基化酶: Dam甲基化酶、Dcm甲基轉移酶和EcoKI甲基化酶。如果你想要消化一個可能被甲基化的限制位點，你可以使用一個甲基化無能力的大腸桿菌菌株(JM11)來繁殖你的質粒。這些大腸桿菌菌株無法甲基化DNA，從而你的限制性酶可以裂解CpG島。
星活性小化
一些限制酶在特定的條件下，它們可能會變得雜亂，隨機消化DNA，而不是在特定的識別位點。這種現象被稱為星活性，通常是由長時間的潛伏期或緩沖條件不佳(如pH)引起的。因此，使用所需的酶與推薦的緩沖液是至關重要的。
此外，高甘油濃度可能會導致星活性增加。由于大多數酶和它們的緩沖液都被包裝成甘油來延長保質期，所以你應該充分稀釋緩沖液和酶。這也是為什么許多公司在他們的通用步驟建議20 - 50?l反應體系和提供10 x緩沖液。
給你的酶一些空間
某些酶在識別位點兩邊有幾個堿基對時效率高。如果你要用雙切，兩種酶位置比較緊密，或者消化PCR產物的末端時，這一點尤其重要。
每個制造商對他們的產品都有具體的建議，但通常建議確保在識別位點的兩邊至少有6個堿基對。添加更多堿基對的簡單方法是通過PCR引物進行設計。盡量避免帶有引物二聚體形成風險的序列。
同裂酶和異裂酶
有時你需要使用一種特殊的酶，它的條件并不適合你的實驗設置。在這種情況下，同裂酶可能會幫助你進行你的實驗，而不會嚴重影響你的終結果。
同裂酶是兩種能識別相同的位點，但具有不同性質的限制性酶，通常來自不同的細菌體系。例如，SinI 和AvaII 都都識別序列G / G(A或T)CC。然而，AvaII是甲基化敏感的，而SinI不是。因此，如果你想要切斷這個序列，并且不想使用甲基化不敏感的大腸桿菌菌株，那么SinI可以滿足條件，而AvaII則不會。
兩種酶具有相同的識別位點，但在不同的堿基對上切割被稱為異裂酶。這可能有助于避免星活性和甲基化敏感性。例如， KpnI和Acc65I都識別這個位點:GGTACC，但在不同的位置切割。KpnI切割bp 5:GGTAC / C，而Acc65I切割bp 1:G / GTACC。KpnI可能會顯示出星活性，而Acc65I則更強健。因此，如果切割位置不重要，Acc65I可能是一個更好的選擇。
